CD8αβ细胞毒性CAR T细胞在实体肿瘤中增殖可以通过携带CAR的单一人诱导多能干细胞克隆中衍生和扩增，实现高效分化。肿瘤中效应细胞的增殖和持久性通过基因敲除抑制抗原受体信号的二酰基甘油激酶，以及编码膜结合白细胞介素-15（IL-15）及其受体亚单位IL-15Rα的基因转导细胞，可以进一步增强肿瘤中效应细胞的增殖和持久性。在多个肿瘤动物模型中，工程化hiPSC衍生的CAR T细胞的治疗结果与带有相同CAR的初级CD8 T细胞相似。优化源自多能干细胞效应性CAR T细胞有助于开发治疗实体瘤的长效抗原特异性T细胞免疫疗法。
图1 CAR构造及CAR-iPSCs分化为T细胞系。
体外扩增过程CAR的调和信号会诱发衰竭表型。不依赖抗原的强直信号会影响CAR工程造血干细胞（HSCs）的淋巴组织，促进NK细胞的发展。相反，从CD19 CAR工程iPSCs衍生的T细胞显示出与γδT细胞相似的表型。补体信号的影响，包括T细胞的分化，取决于CAR结构。研究人员评估了具有相同scFv的不同CAR构建体对iPSCs的T细胞分化的影响。结果显示：在培养过程中，iPSCs或分化细胞上没有表达CAR的靶向分子，如CD19，在scfv-deleted构建下，分化为DP细胞的过程没有中断，同时在分化的细胞中，1928z的CAR诱导而非1928bbz诱导会引起CD3ζ的磷酸化，表明非特异性的激活信号。在DP细胞富集阶段（第35-42天）的CAR诱导减少了CD4、CD8 DP细胞的数量，增加了CD8单阳性（SP）细胞的数量。此外，1928z诱导增加了NK细胞相关基因的表达。
图2 iCAR-TCTL对肿瘤进展的抑制和在体内向肿瘤部位积累比iCAR-TILC更好，但未达到pCAR-TCTL。
从CAR工程iPSCs中再生的1928z CAR-T细胞发挥抗肿瘤功能与用相同的CAR转导的γδ T细胞相近。因此，从CAR-iPSCs中通过CD4CD8 DP产生的CD8αβ阳性T细胞可增强抗肿瘤功能。虽然CAR-T疗法对血液恶性肿瘤有效，但对实体瘤的效果较差。研究人员为开发一种iPSC衍生的CAR-T疗法来治疗实体瘤，产生了表达CAR的iPSC衍生的NK/innate淋巴细胞（ILCs），目标是表达glypican3（GPC3）的肿瘤，如肝细胞癌和卵巢透明细胞癌。CAR-iPSCs通过造血祖细胞被诱导形成未成熟的T细胞，对应于CD4CD8 DP群体。未成熟的iCAR-T细胞和成熟后的iCAR-T细胞对外周CD8 T细胞表达的表面抗原CD5和CD8β表现出异质性的表达谱。此外，这些细胞显示了CD62L、CCR7、CD27和CD28的异质性表达模式，主要表达于幼稚和中央记忆T细胞。总之以上结果表明，iCAR-TCTL在功能上可能比iCAR-TILC更接近于pcar-TCTL。然而，与pcar-TCTL相比，在癌症免疫的多个方面存在不足。
图3 信号增强改善iCAR-TCTL积累、持久性和效应功能
接着Phosflow试验评估T细胞中DAG下游磷酸化情况。尽管iCAR-TCTL的ERK1/2磷酸化低于pCAR-TCTL，但当细胞受到目标抗原刺激时，DGK-dKO-iCAR-TCTL显示出与pCAR-TCTL相似的ERK1/2磷酸化增强。与DGK-未修饰的iCAR-TCTL相比，DGK-dKO-iCAR-TCTL对SK-Hep-GPC3的增殖能力明显提高。此外，在对SK-Hep-GPC3的反应中，观察到DGK-dKO-iCAR-TCTL的IFNγ和TNF产生改善。为了确定DGK中断是否改善了iCAR-TCTL在肿瘤部位的效应功能和治疗持久性，通过腹腔注射DGK-dKO-iCAR-TCTL来治疗NSG小鼠的卵巢癌细胞株KOC7c的腹腔内传播模型。与iCAR-TCTL相比，DGK-dKO-iCAR-TCTL明显抑制了肿瘤的生长，并将小鼠的生存期延长到与pCAR-TCTL治疗组相当的水平。皮下肿瘤体内成像表明DGK-dKO-iCAR-TCTL比iCAR-TCTL在皮下肿瘤部位积累更多，持续时间更长。
图4 组合信号增强iCAR-TCTL
研究人员将1×106个测试细胞静脉注射到JHH7预接种的皮下实体瘤模型中。与腹腔注射模型得到的结果相似，
DGK-dKO-iCAR-TCTL-mbIL15tg显示出明显的肿瘤控制和生存率，而同样的组合信号增强pCAR-TCLT有效性较弱。注射后28天的外周血FCM分析证实，在所有队列中只有DGK-dKO-iCAR-TCTL-mbIL15tg被检测到，表明IL-15介导的DGK-dKO-iCAR-TCTL的持久性改善对实体瘤模型的疗效。接下来，研究人员评估了基因修饰对iCAR-TILC与iCAR-TCTL治疗影响，以了解这些修饰是否产生了比iCAR-TCTL更好的iCAR-TILC。与DGK-dKO iCAR-TCTL相比，未发现DGK-dKO iCAR-TILC在ERK磷酸化和与SK-Hep-GPC3共培养中任何优势。以上结果表明，基于iCAR-TCTL的修饰细胞将有助于实体瘤的免疫治疗。IL-15表达和DGK破坏的组合在体外有信号增强和增殖优势，在体内导致T细胞生存和肿瘤抑制能力增强。增强IL-15的组合信号iCAR-TCTL可以构成不同CAR修饰的再生T细胞免疫疗法的基础。
总之，本文重述了从iPSCs获得强效CD8αβ细胞毒T细胞的体外分化过程，利用共刺激信号成分选择工程化的淋巴细胞通路，解读CAR修饰的iPS-T细胞（iCAR-T细胞）的特征，并增强iCAR-T细胞对实体瘤的效应功能。通过一些基因修饰来增强CAR-T疗法的治疗效果可行，未来将T细胞的人工设计作为一种针对实体瘤的癌症免疫治疗策略具有重大应用前景。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41551-022-00969-0
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