百蕊草种子休眠的破除与生理变化研究

 百蕊草Thesium chinense Turcz.为檀香科多年生半寄生草本植物，其干燥全草为我国民间常用中草药，具有显著抗炎、解暑、镇痛和广谱抗菌作用，被称为“植物抗生素”。近年来，由于大量采挖，其野生资源日渐枯竭，已满足不了用药需求，因此，进行百蕊草野生抚育或人工栽培具有重要的现实意义。但是其种子存在深度休眠现象，在自然条件下，需要一夏一冬才能萌发，大量种子在休眠期间丧失活力。因此，种子深度休眠极大地限制了百蕊草的实生繁殖和种群生存发展。

 本文主要研究不同浓度GA3溶液浸种及低温层积不同时间对破除百蕊草种子休眠和萌发的影响，并分析其种子破除休眠前后的生理变化。为探讨百蕊草种子休眠机制，实现打破其种子休眠提供理论依据和实践指导。

 1  材料和方法

 1.1 材料

 2008年5月在江苏句容、安徽滁州和来安等地采集的百蕊草种子。自然风干后，精选成熟饱满颗粒贮存于4℃条件下。原植物经南京农业大学郭巧生教授鉴定为檀香科植物百蕊草T. chinense。

 1.2 种子休眠的破除

 种子前处理:百蕊草种子用流水冲洗24h，然后分别用质量浓度为0(A)，50(B)，500(C)，1000(D)mg·L－1的GA3溶液浸泡24h备用。

 种子低温层积处理:将前处理后的种子与湿润细沙按1∶3的比例均匀混拌，装入聚乙烯薄膜袋内，放置于3~5℃冰箱中层积处理，定期搅拌翻动种子以保持良好的通气性，并检查基质含水量，基质含水量以“手握成团，松手即散”为宜(约为2%)。分别于层积30，60，90，120，150，180，210，240，270 d时取出种子，随机数取100粒，蒸馏水冲洗干净，计数裂壳种子数，然后取裂壳种子置于铺有2层滤纸的9cm培养皿中，加4mL蒸馏水，在20℃黑暗条件下进行萌发试验。

 1.3 种子层积前后内含物与激素含量的测定

 取未层积种子和层积并裂壳的种子，剥取种仁，分别测定总糖，可溶性糖，粗脂肪，GA3，ABA和水分含量。

 1.3.1 总糖和可溶性糖含量测定 用蒽酮硫酸比色法，756-CRT紫外-可见分光光度计测定。

 蒽酮硫酸液配制:称取0.3g蒽酮，溶于80%硫酸液中，并定容至100mL，黑暗中保存备用。

 可溶性糖含量:取0.1g种仁，放入研钵中，加入2mL蒸馏水，研磨后转入50mL三角瓶，用8mL蒸馏水冲洗研钵2~3次，转入三角瓶，封口，在100℃水浴上煮沸30 min，冷却后定容至100mL，过滤，备用。取1mL提取液，加入4mL蒽酮硫酸液，摇匀，100℃水浴10 min，冷却后，于620nm测定吸光度A。

 总糖含量:取0.1g种仁，放入研钵中，加入2mL蒸馏水，研磨后转入50mL三角瓶，用8mL蒸馏水冲洗研钵2~3次，转入三角瓶，加入6mol·L－1盐酸10mL，封口，在100℃水浴上煮沸30 min，冷却后用10%NaOH调pH至7.0，用蒸馏水定容至100mL，过滤，备用。其余同可溶性糖含量测定。 

W含糖量(%);C1提取液中糖质量浓度(mg·L－1);V1提取液体积(mL);m样品质量(g)。

 1.3.2 种子粗脂肪含量测定 取1.0g种仁，研磨后，110℃烘2 h，称重W1，用滤纸包好，用石油醚索氏提取7 h，挥干石油醚，残渣称重W2。

  1.3.3 内源GA3与ABA含量测定 GA3与ABA的提取纯化参照刘剑锋等的方法，并略加修改。精确称取1.0000g种仁，放入冰冻的研钵，加80%冷甲醇3mL，冰上研磨成匀浆，转入预冷的50mL烧杯，用80%冷甲醇20mL冲洗研钵2~3次，转入烧杯，4℃避光条件下振摇过夜，过滤，残渣再用80%冷甲醇提取2次，过滤，合并滤液，冷冻干燥浓缩至5mL，取2mL过0.45μm微孔滤膜，备用。

 采用高效液相色谱法测定GA3与ABA含量。Agilent 1120液相色谱仪，流动相甲醇-水(含0.5%0.1mol·L－1磷酸)60∶40，流速1.0mL·min－1，柱温35℃，进样量20μL，检测波长ABA245nm，GA3208nm。

 1.3.4 含水量测定 含水量用烘干法。将称量盒于105℃下烘干至恒重，称重。取样品约1.0g，将样品放入盒内，打开盒盖，一起放入预先预热至110℃的烘箱内关好箱门，保持(105±2)℃，10 h后取出，盖上盖子置于干燥器内冷却后称重;再放入(105±2)℃烘箱内2 h取出，盖上盖子置于干燥器内冷却后称重，直至后次称重和前次称重不超过0.002g为止，记下最后一次质量作为烘干后质量。进行水分含量计算。

 W1烘前种子质量，W2烘后种子质量。

 3  结果

 3.1 层积过程中种子裂壳率与发芽率的变化

 百蕊草种子层积后，宿存花被脱落，种壳厚度变薄，表面出现不规则块状破损或裂缝。种子裂壳率随层积时间的变化见表1。低温层积不同时间对种子裂壳率有显著影响，随层积时间的延长，种子裂壳率逐渐提高。至180，210 d时，处理B和C的裂壳率分别为22.00%，23.04%，27.00%和27.73%，且层积180，210 d种子裂壳率没有差异，但显著高于层积30~150 d各处理。实验中还发现，层积120 d时，裂壳种子生活力最强，从层积150 d起，部分裂壳种子开始失去生活力，出现坏死现象，表现为胚乳变软，颜色由乳白变为黄色，随层积时间延长，裂壳种子坏死率逐渐提高。至180，210 d时，裂壳种子坏死率分别达到2.27%，38.26%。因此，百蕊草种子以层积150~180 d为宜。

  层积前，不同浓度GA3浸种24 h，对层积过程中种子裂壳率有一定影响，500mg·L－1GA3浸泡24 h处理，显著高于其他处理，层积150 d时，种子裂壳率为22.00%。1g·L－1GA3浸泡24 h处理显著抑制种子裂壳。

 不同层积时间，百蕊草种子发芽率分别为0(30 d)，6.79%(60 d)，30.01%(90 d)，52.69%(120 d)，68.47%(150 d)，52.37%(180 d)，48.75%(210 d)。低温层积时间长短对百蕊草种子萌发有显著影响，随层积时间的延长，百蕊草种子发芽率呈现先升高后下降的趋势。层积150 d发芽率最高，其后随层积时间的延长，发芽率下降。主要是由于150 d前，种子生活力随层积时间的延长，逐渐增强;150 d后种子生活力逐渐下降，裂壳种子坏死率增加所至。

 3.2 种子层积前后内含物与激素含量的变化

 种子层积前后内含物与激素含量的变化见表2。种子层积裂壳后，不仅含水量大幅度增加，内含物与激素含量也发生了巨大变化。粗脂肪减少了50%以上，由层积前的57.44%减少到27.94%。总糖和可溶糖增加了3~4倍，分别由层积前的5.49%，3.66%增加到16.41%，13.95%。GA3和ABA变化最剧烈，ABA减少了90%以上，由82.65μg·g－1减少到6.79μg·g－1，而GA3则增加了5倍以上，由5.06μg·g－1增加到28.79μg·g－1，使得GA3/ABA比值由层积前的0.06增加到4.24，是原来的69.24倍。

 4  讨论

 许多实验证明低温层积处理对打破种子休眠有促进作用，尤其是对一些具有深度休眠的种子效果更加明显。李先恩等研究黄连种子指出，低温层积的作用在于促使抑制类物质逐步分解，而生长类物质逐步增加，从而使种子破除休眠而萌发。于淑兰亦指出适宜的预湿冷层积加速了落叶松种子萌发，促进发芽整齐，幼苗生长健壮。本研究发现，用流水冲洗24 h再低温层积处理，粗脂肪含量减少了50%以上，总糖和可溶糖增加了3~4倍，GA3则增加了5倍以上，ABA减少90%以上。可能是因为低温层积过程中，一是触发了种子内部物质代谢的启动，从而促进了胚乳中贮藏物质的转化，特别是打开了闭锁状态的赤霉素的生物合成途径，为胚体发育提供物质准备;二是加速了抑制物质的降解，种子中主要抑制物质在低温层积下比干藏状态下降解的要快。同时，百蕊草种子成熟时种胚体积小、活力低，胚吸收胚乳中的养分，长满胚腔需要一定积温，因此需要经过120~150 d的层积，这是胚进一步发育的前提条件。

本研究发现，用流水冲洗24 h再层积的方法虽能打破百蕊草种子休眠，但是与流水冲洗24 h+GA3浸泡24 h后再层积相比，需要更长层积时间来增加种子内促进萌发物质的含量而破除休眠。很多研究认为，GA3溶液浸种可以部分破除种子休眠，是因为GA3能促进种子内部的生理生化变化。本研究中，用GA3溶液浸泡后再层积，可以促进百蕊草种子裂壳，使种子萌发提前，发芽率也有所提高，这表明百蕊草种子的休眠还与种子中缺乏萌发促进物质有关。赤霉素溶液处理可促进种子的提早发芽，正是是由于适量外源GA3的加入改变了种子内的激素比例，GA3/ABA由层积前的0.06增加到4.24，是原来的69.24倍。在赤霉素的诱导下生成和激活了水解酶，促进核酸和蛋白质的合成，使处于休眠状态的胚恢复伸长生长，当胚长度充满整个胚腔时，种壳裂开，在从而促进种子提早发芽。另一方面，本研究又发现，单独用GA3浸泡并不能彻底打破百蕊草种子的休眠，而不经过GA3处理直接用流水冲洗24 h再层积的方法也能打破休眠，但是需要更长层积时间来增加种子内促进萌发物质的含量而破除休眠。这是因为外源萌发促进物质只能部分破除百蕊草种子休眠，而达不到低温层积处理过程中种子内部所发生的一系列生理生化变化的效果。