动物药材作为中药材的重要组成部分, 具有悠久的药用历史, 历代本草中都有动物药材的记载。目前动物药材的应用已达974味、涉及药用动物1 546种、组成方剂1 049首[1]。但由于对动物药材的研究相对较少, 尤其是基础研究较薄弱, 致使动物药材应用中品种混乱, 药材质量良莠不齐的现象时有发生, 如何建立一套简便、快速, 且行之有效的动物药材品种鉴定与质量评价体系, 是亟待解决的一个重要课题。有关中药材质量评价的方法, 目前多是采用模式识别[2]、“一测多评”[3]、“基于道地药材和生物效价检测的模式”[4]等方法。而动物药材或因大多为蛋白质、多糖、核苷等大类化学成分, 很难将其各部分成分与药材的功能主治一一对应, 进行动物药材的质量评价;或因药用动物目前大多进行了人工饲养, 很难保证原有道地药材的特质, 并且动物药材的生物效价检测的手段除水蛭外, 还没有通用的方法。因此, 如何能结合动物药材的特点, 寻找出符合当前动物药材应用实际的检测方法与指标, 是解决动物药材品质评价问题的关键。为此, 本课题在对10味具有代表性的常用动物药材进行品种评价研究的基础上, 提出以指纹图谱 (HPCE、HPLC) 技术, 进行动物药材的品种鉴定;在对各药材样品主要成分分析的基础上, 采用数据挖掘技术, 以灰关联度模型进行动物药材质量评价研究;以多元相关分析、逐步回归分析方法, 进行动物药材检测指标的简化与优化, 以有效简化动物药材的质量控制方法;以中国药典规定的铜、汞、铅、砷、镉等5种有害元素限量为标准, 进行动物药材使用安全性初步监控与评价等, 从而构建动物药材较为完善的品质评价体系 (图1) 。

图1 动物药材品质评价体系技术路线图

1实验材料的选择

本研究按照药用动物的进化类型, 选择在来源上具有代表性的10味常用动物药材:水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、僵蚕 (包括生品、制品) 、蛤蚧、蕲蛇、乌梢蛇、鹿鞭, 收集各药材不同地区的商品药材每种各10批, 水蛭 (包括水蛭、蚂蟥) 、地龙 (广地龙、沪地龙) 各20批, 经鉴定后处理备用。

2品种鉴定的指纹图谱研究

中药指纹图谱因其具有系统性、特征性和稳定性的特点, 而被作为一种综合的、宏观的, 以及可量化的鉴别手段, 广泛用以对中药材和中成药进行真伪鉴别[5]。本研究根据动物药材的化学成分特点, 分别主要采用高效毛细管电泳法 (HPCE)[6], 测定药材各样品指纹图谱, 以“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”, 建立各药材的特征指纹图谱, 并计算各药材样品与对照药材 (仅土鳖虫有对照药材) 或共有模式的相似度。通过比较各药材样品的相似度发现, 单一来源药材中除蛤蚧[7]有一个样品外, 大多数药材样品的相似度达到或接近0.9[8], 表明各地药材的品种具有相似性;其中, 土鳖虫药材均为地鳖Eupolyphaga sinensisWalker[9]。多来源药材中, 地龙药材各样品的相似度差异较大, 与该药材的多来源相吻合;广地龙与沪地龙药材样品比较, 广地龙各样品相似度的一致性高于沪地龙, 这也与广地龙来源单一相吻合[6]。

3质量评价的灰关联度模型研究

3.1灰关联度模型的基本理论

灰关联分析是灰色理论[10]的基本内容, 灰色关联分析的基本思想是根据曲线间相似程度来判断因素间的关联程度。灰色关联度描述了系统发展过程中, 因素间相对变化的情况, 即变化大小、方向与速度的相关性。如果两者在发展过程中, 相对变化趋势存在相关性, 则可用一定的关联度来表示两者之间的关系。根据序列之间的关联度的大小, 可以定量判断两序列之间的关联程度, 而且, 应用关联矩阵还可进行多因素情况下的优势分析。其与传统的相似性分析方法相比[11], 具有简单、直观和计算量小的优点, 同时对样本量的大小没有过高的要求, 不需要典型的分布规律, 而且其定量分析的结果与定性分析的结果一般能够吻合。所以, 在对存在不确定性知识的灰色系统进行分析时, 其具有不可比拟的优越性能。也正是灰色系统理论对不完备信息的处理能力, 以及其能够充分利用现有数据, 简单、客观进行综合评价的特点, 使他已广泛应用于经济评价、项目评估、投资决策、环境检测、人员考核及机械加工的过程控制与质量评价等, 信息量较少, 并且涉及多方面因素, 且这些因素往往是相互影响、非独立的、具有诸多有待评价因素的灰色系统。而中药材尤其是动物药材恰恰符合灰色体系的特点。关于灰色关联分析中的关联度计算方法有很多[12][13][14][15][16][17][18][19], 本研究采用的是以相对关联度为测度的计算方法[17], 因为该方法是在一定数量的样品和一定数量的指标数据建立的数据集中, 通过计算样品与最优和最差序列的相对关联度, 来构建质量评价模型, 更适合于动物药材商品这样多序列间的相关分析。

3.2灰关联度模型的建立与质量评价

根据动物药材的成分特点[20], 分别采用高效液相色谱法、分光光度法等方法, 测定各药材样品中主要成分 (核苷类、总磷脂、总多糖、水溶性蛋白质、多胺类等) 含量;应用灰色关联度模型, 通过建立各指标性成分的最优、最差参考序列, 计算样品指标与最优、最差参考序列的关联系数、关联度及相对关联度, 以相对关联度ri的大小排序进行药材样品的质量评价[21]。结果发现, 各药材不同样品质量均存在一定差异[21][22][23][24][25][26][27][28], 并且这种差异未随药材品种的单一而减小。如土鳖虫样品虽为同一品种, 但各样品的相对关联度ri值在0.79~0.32之间[27], 即各样品的质量差异较大。多来源的地龙、水蛭药材中, 各沪地龙样品的相对关联度ri值变化较小, 表明其药材质量较接近, 而各广地龙药材的ri值变化则较大, 即质量差异较大;各水蛭样品中的相对关联度ri值变化较小, 表明其药材质量较接近;而蚂蟥药材则质量差异较大, 这可能与其药材来源为多品种有关[25]。同一药材僵蚕的生品与炮制品比较, 其炮制品的相对关联度值较生品的高, 表明炮制品的质量较好, 这与传统僵蚕多炮制后使用相吻合[28]。

4检测指标的简化与优化

由于动物药材的有效成分多不明确, 因此在质量评价过程中, 其检测指标越多则评价结果与实际相符合的程度会越高, 但同时也造成了检测繁琐和不必要的浪费。为此, 本研究根据传统中药多为水煎、口服的应用方式, 选择动物药材水溶性成分为主要因素, 即因变量, 其他成分为次要因素, 也即为自变量, 通过采用多元相关分析的数学模型, 建立各药材总核苷含量为因变量与其他成分含量间的关系方程, 以期探讨各动物药材中主要成分间的相互关系, 从而简化其质量控制的指标;同时, 采用逐步回归分析的数学模型, 建立各药材中核苷类组分对总核苷含量影响的最优关系方程, 以寻找各药材核苷类组分中, 对总核苷含量影响最大的组分, 进而优化质量控制中各药材核苷类成分的检测指标。

4.1检测指标的简化

本研究在进行质量评价过程中, 对各药材样品分别检测了5类或以上的成分, 为建立各药材中每类成分间的相互关系, 选择以各药材中的水溶性核苷类成分 (水蛭则选择抗凝血酶活性) 的含量为应变量, 其他类成分的含量为自变量, 进行多元相关分析, 分别建立了各药材主成分间的多元关系方程, 通过各自变量与因变量的成分间的正、负相关性, 确定各药材质量控制中最简化的测定指标。以鹿鞭药材为例[29], 其各主成分关系方程为:

Y=0.02918X1-0.3865X2+0.0866X3+0.0104X4-0.0083X5-1.6392

即鹿鞭药材中总核苷的含量Y与睾丸酮X1、总多糖X3、总多胺X4含量呈正相关 (Y 可标示X1、X3、X4的量) , 与总磷脂X2、总氨基酸X5含量呈负相关。理论上可以减少呈正相关的指标的检测, 即可用总核苷含量标示睾丸酮、总多糖、总多胺的含量;也就是说鹿鞭药材质量控制中可仅检测总核苷、总磷脂、总氨基酸的含量;以此类推, 各药材的质量控制检测均有不同程度的简化[22, 25, 30][22, 25, 30][22, 25, 30]。

4.2检测指标的优化

在对各药材进行核苷类成分分析时, 由于核苷类成分的种类较多, 同样有检测繁琐的问题。为找出对总核苷含量影响最显著的指标, 本研究采用了逐步回归的方法, 分别通过建立总核苷含量与各核苷类成分间的最优关系方程, 筛选各药材样品中对总核苷含量影响最显著的组分, 以优化核苷类成分的检测指标。仍以鹿鞭药材为例[31], 其最优关系方程为:

Y=1.408X2+1.462X3+1.347X4-0.0202

结果表明在检测的5种核苷类成分 (腺苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶及尿苷) 中, X2、X3、X4对总核苷含量有重要影响;由统计量F值 (分别为:6.5587、35.3640、15.1388) 分析, 以X3对Y的影响最显著 (F值最大) , 即可以黄嘌呤含量标示鹿鞭药材中总核苷含量;同理, 筛选出了其他几种动物药材中对总核苷含量影响最显著的组分, 从而优化了各药材的核苷类成分检测指标[22, 25, 30][22, 25, 30][22, 25, 30]。

5安全性评价

影响中药安全性的主要因素除药材内源性次生代谢产物外, 还有外源性的物质, 如有害元素、农残以及二氧化硫、黄曲霉毒素等[32]。本研究根据动物药材的特点, 以有害元素铜、汞、铅、砷、镉等为检测指标, 采用电感等离子耦合质谱及原子吸收等方法, 对各药材样品进行含量测定[22, 25, 29, 30][22, 25, 29, 30][22, 25, 29, 30][22, 25, 29, 30], 结果显示:除土鳖虫、蜈蚣、僵蚕、乌梢蛇、蛤蚧 (仅有1份样品铜含量超出标准) 药材外, 其他各药材样品的5种有害元素含量, 均不同程度超出2010版中国药典的限量要求。如地龙药材样品5种有害元素含量均超出标准;水蛭药材仅有一半样品的铅含量符合标准, 其余样品的5种有害元素含量也都超出标准;全蝎药材的镉、铜含量超出标准;蕲蛇药材有一半样品的汞含量超出标准;鹿鞭样品的铜含量都超出标准。在所有的超标现象中除鹿鞭药材的铜超标, 可能与使用铜铳粉碎有关外, 其余均应是源于药材自身。由此可见, 动物药材中有害元素超标导致的药材安全隐患值得关注。

本项研究自2004年以来, 先后完成了8味药材90批样品的指纹图谱鉴定;10味药材120批样品的质量评价;检测指标的简化与优化, 以及安全性评价研究, 取得了较理想的效果。本评价体系中4项内容的核心是质量评价的灰关联度模型。灰色理论及模型已广泛应用于经济、环保、农业、机械加工等领域中的质量评价研究。灰色系统的最大特点是, 解决已知信息量较少, 系统内部关系较复杂体系的系统评价。因此, 本评价体系不仅适合于动物药材的品质评价, 也适合于其他类有效成分不明确的中药材质量评价。