朱伟豪,吕翔,沈莉莉,王姣姣,朱雨雨,段金廒,曹鹏,周婧通讯作者,马宏跃通讯作者
(南京中医药大学药学院,江苏省方剂高技术研究重点实验室江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏南京210023)
动物药是传统中药的重要组成部分,临床用于治疗疾病历史悠久,其特色鲜明、疗效出众。祖国医学认为动物脏器气味醇厚,为“血肉有情之品”“行走通窜之物”。根据同气相求原理,其较草本药物更易被人体吸收,且量小力雄,能克顽疾。清代医学家唐容川在其《本草问答》中写到“动物之功利,尤甚于植物,以其动物之本性能行,而且具有攻性”。清代著名温病学家叶天士曾言:“久则邪正混处其间,草木不能见效,当以虫蚁疏逐,以搜剔络中混处之邪。”由此可见,自古以来动物药在功效上有其独特之处,备受医家推崇。此外,临床应用的动物药数量众多。在《神农本草经》记载的365种中药中,动物药有67种,约占18.4%。明代李时珍编写的《本草纲目》中共记载1892种中药,其中动物药461种,约占24.4%。可见,动物药在中医药学中具有不可或缺的重要地位。
近年来由于产业需求增加,部分动物药资源紧张的现状较为严峻。解决珍稀动物药资源问题,有2种常用方式人工饲养繁育和代用品开发。对于部分药用动物,人工养殖成绩显著,特别是鹿、熊、麝、林蛙、蛤蚧、水蛭等资源数量明显增加。但是,仍然有相当多的珍稀动物,其人工饲养面临较大困难,或者人工产量有限,无法从根源上解决资源不足的难题,比如,赛加羚羊、穿山甲、蟾蜍等。因此,代用品开发是解决这一资源难题的重要途径。目前,已有多个成功的案例,如人工牛黄、人工麝香、人工熊胆粉,或山羊角代羚羊角等,均已在中医药产业中广泛应用。为后续其他珍稀动物药代用品研究提供了较好范式和借鉴。
鉴于动物药代用品重要性,本文对其研究历史、研究策略、思路与方法进行了系统梳理、总结和论述。
1动物药代用品的研究意义
1.1临床和产业价值巨大
珍稀动物药在中成药中广泛使用,用于多种急病、重病的治疗。麝香是一个典型的例子。据统计临床有433种中成药使用麝香,如用于脑卒中的急救药物安宫牛黄丸中就含有名贵中药麝香。管业明等对经微创血肿引流术后加用安宫牛黄丸,与对照组相比安宫牛黄丸可显著缩短患者的昏迷时间。另有研究表明,安宫牛黄丸也可显著抑制脑出血患者48h内的血肿扩大,并能促进14d后的血肿吸收。然而,天然麝香资源短缺,价格昂贵,天然原料不能满足工业生产。为此,众多学者开展了其代用品的研究。董世芬等比较含天然麝香或人工麝香的安宫牛黄丸对大脑中动脉栓塞(MCAT)和大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)动物模型的保护作用,结果显示含人工麝香或天然麝香的安宫牛黄丸展现出的药效无显著性差异。楼黎明对含人工麝香或天然麝香的安宫牛黄丸的研究,发现两者对小鼠脑缺血损伤、缺氧损伤、内毒素休克及戊四氮所致惊厥的保护作用均无显著性差异。证明人工麝香替代的可行性。
人工麝香的成功研制,一定程度上有效地缓解了麝香供需矛盾的问题。据报道,平均每年的工业附加值提高上亿元。可见,动物药代用品的重大贡献和价值。
1.2生态效益不可估量
当前很多野生药用动物资源极其匮乏。例如,野生赛加羚羊在我国境内已经灭绝;穿山甲作为我国特有的药用动物之一,也已经面临濒危。熊胆在治疗肝胆疾病、眼科疾病等方面,具有显著药效。然而,黑熊和棕熊也一度濒危,列为国家二级重点保护动物。
除了上述多种濒危动物外,较为多见的中华大蟾蜍种群数量也在急剧减少。蟾蜍目前是三有野生保护动物,而每年巨大的产业需求导致大量野生蟾蜍被抓捕,严重破坏了生态环境的平衡。一般而言蟾蜍捕食能力强于青蛙,1只蟾蜍1d能捉70多只昆虫,每年吃掉约15000只害虫。特别是当前昆虫种群变化快,像灰飞虱、稻飞虱等害虫很难靠化学农药消灭,但蟾蜍能够出色地发挥生物杀虫的功能。如若不再捕杀,每年便可保护5亿只蟾蜍,可以覆盖500万亩(1亩≈667m2)耕地,预期减少50%的杀虫剂用量,其生态效益和绿色价值不可估量。
因此,珍稀动物药代用品的研究,对推动中医药产业、绿色发展和生态环境保护,意义重大。
2动物药代用品的研究策略
目前,主要有3种研究策略,见图1。
2.1近效替代策略
近效替代是指采用功效相似的动、植物进行资源替代,达到与原药材疗效相近的一种策略。近效替代是一种较为简单、高效的策略,最为经典的例子是山羊角代替羚羊角。卫生部、商业部曾于1977年组织内蒙古、北京、江苏、上海等地区的相关单位制定计划,以寻找与羚羊角相同疗效的药物,开发新的药物资源。经过对各种羊角化学、药理、临床的科学研究,1987年5月卫生部药政局和中国药材公司发文,认为鹅喉羚羊角、黄羊角、山羊角同羚羊角具有相似功效,这3种羊角可作饮片配方和配制中成药、亦可用于单方。
但是后续的药理活性评价发现,山羊角的活性明显弱于羚羊角。例如,陈芙蓉等通过抗惊厥解热实验,发现山羊角替代羚羊角的比例范围为6.0∶1~7.2∶1。曹欢采用山羊角对麝香脑脉康胶囊中的羚羊角进行替代,发现替代后处方具有相近药理作用,但该药中山羊角与羚羊角的替换比例为8∶1。可见,山羊角与羚羊角虽为近效,但两者在替换比例上并不等效。
除了羚羊角之外,还有其他的近效代用品研究。吕鹏月在对紫河车及其代用品的研究中发现,猪、牛、羊胎盘在各药效学指标中与紫河车组无显著性差异,认为他们药理作用近似。有学者通过13项实验及药理指标表明人工虎骨与虎骨之间的药理作用无显著性差异,可近效替代使用。由此可见,近效替代在延续和挽救相关中成药品种方面有重要作用。但是,近效代用需要注意药效强度差异和代用比例的问题,实现等效代用仍任重道远。
2.2成分组合策略
成分组合是指在明确原药材关键疗效成分的基础上,采用化学成分组合的方式,达到与原药材相同或相近的一种策略。应用该策略较为经典的例子是人工牛黄。人工牛黄从20世纪50年代开始研究,从牛胆汁提取到合成胆酸,20世纪80年代配方定型,目前正逐渐向高胆红素配方发展,见表1。药效研究显示人工牛黄可以替代天然牛黄。李士懋对痰热壅盛化风导致的高血压病眩晕研究,发现人工牛黄的治疗作用显著,能有效地缓解病症。
人工熊胆粉是采用成分组合策略的又一成功案例,利用熊胆中关键药效成分牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸等化学成分的组合配制人工熊胆粉。有学者研究发现人工熊胆粉在利胆、镇静方面的药效完全接近天然熊胆粉。以胆酸等为初始原料进行化学合成熊去氧胆酸主成分单体,也可单独作为化药用于肝脏等疾病的治疗。
总之,通过成分组合策略,可以有效地缓解部分濒危动物药的缺少问题,但由于中药具有成分复杂的特性,许多药效成分尚未明确的药材难以采用此方法进行代用。
2.3近效代用品添加功效成分的组合策略
该组合策略是指在近效替代品无法达到原药材的疗效时,在近效代用品中添加原药材中主要功效成分,以实现对原动物药材的替代,接近其疗效。实际上,该策略是对前面2个策略的折中。采用该策略的原因是有些动物药目前无法准确识别关键活性物质,或者其关键活性物质为复杂成分的组合,关键成分难以通过人工方式获取。因此,在近效代用的基础上,进一步添加原药材中标志性化学成分或者代表性活性成分,从而使获得的代用品实现对原药材的替代。
例如,人工麝香中麝香酮类成分可通过化学合成的方式得到,但麝香中水溶性蛋白或多肽难以通过人工方式大量制备,由此采用了其近效替代方法,从其他动物药中提取水溶性抗炎物质,再进一步加入麝香酮等关键活性成分,形成人工麝香。通过多种药理学和毒理学测评,证明两者等效,可以等同入药。
以人工麝香研制为启发,羚羊角替代品也可采用该策略。山羊角与羚羊角的活性成分具有一定的相似度,通过鉴定、筛选出羚羊角中的特征性物质,比如角蛋白源多肽,微量元素或甾体成分,通过化学合成或生物合成制造的方法获取这些关键成分,并与山羊角进行组合,以期实现1∶1或相近比例的替代。鉴于许多濒危动物药功效成分的多样性,可以预测该策略在未来将会被更多地使用。
3研究方法
3.1基于组学技术的药效物质基础研究
明确珍稀动物药独特疗效物质基础研究是能否进行替代的关键。动物药中发挥主要药效的成分有蛋白质、多肽、核酸等大分子化合物,同时还含有甾体类、微量元素等小分子化合物。
绝大部分动物药中主要含有蛋白质及多肽等大分子化合物。近年来,蛋白质组学、多肽组学、转录组测序等相关技术的发展,为明确珍稀动物药物质基础提供了研究方法。有研究基于denovo转录组测序建库,实现了对名贵中药蟾酥中蛋白组的系统鉴定,为人工蟾酥研制提供了关键依据。王姣姣等采用细胞亲和力筛选的方法,进一步鉴定了蟾毒中关键活性多肽。LIUR等基于蛋白质组学的方法,共鉴定出犀角、水牛角、羚羊角、山羊角的非共有蛋白质分别为74、70、137、129个,同时鉴定出64个以角蛋白及结构蛋白为主的共有蛋白质,为犀角和羚羊角等珍稀动物药材的代用品研究提供了参考。
此外,BAIG等采用蛋白质组学的方法,得到地龙中特定的蛋白质组分,并建立了相关组分含量测定方法,为地龙质量评价提供了方法依据。由此可见,应用蛋白质组学及多肽组学等组学技术为明确珍稀动物药的物质基础提供了研究思路和技术手段,见图2。
3.2关键疗效物质的绿色制造
在明确独特疗效物质基础及其作用机制后,药效物质的高效绿色制造是当前需要解决的难点问题。化学合成技术是有效的传统方法。除此之外,生物技术也备受重视。BERGMANNC等将通过化学合成的寡聚脱氧核苷酸,通过相关酶的连接,最终得到了全长为226bp的水蛭素基因。该合成基因与β-半乳糖苷酶作为1个融合蛋白得到了表达,并表示该蛋白的表达产物具有水蛭素的生物活性。申同健等通过对水蛭素HV2的氨基酸序列的分析,设计并合成了水蛭素基因,并在酵母中的α因子表达系统中进行表达,最终通过纯化得到纯水蛭素。经验证,其N-端的氨基酸序列与天然水蛭素完全相同,且具有较强的抗凝血和抑制凝血酶的活力。水蛭素的成功合成,提示了合成生物学在珍稀动物药独特疗效物质的高效绿色制造方面具有广泛的应用前景,未来,随着生物合成技术快速发展,必将发展出更为高效和绿色环保的制备工艺。
近年来兴起的类器官技术,也为动物药代用品制造提供了新的方向。类器官(organoids)是从干细胞中生长,并能基本再现组织基本特征的自组织3D结构。例如,将蛇类的毒腺分离并嵌入到基底膜提取物中,添加“通用型”哺乳动物类器官混合培养基,使蛇类毒腺的类器官启动初始扩展,最终培养出毒腺类器官。从中可以得到启发,是否能够利用这类技术培养出分泌关键疗效物质的动物药类器官,为珍稀动物药代用提供新的研究策略和技术手段,见图3。
3.3围绕动物药功效的多样化药理学评价仍必不可少
药理学研究是贯穿着药效物质追踪、组方优化、等效代用的关键步骤。研究应在单药和复方成药2个层面进行药理学、药动学和毒理学的等效评价。这种基于整体动物模型的系统而多样的药效、药代和安全性评价,是证明替代可否的关键。但需要注意的是,相关模型的选择和设计不能脱离中医药临床,否则研究可能无法反映出该名贵动物药的功效及治疗特点,从而导致等效性评价出现大幅偏颇。
4总结与展望
当前珍稀药用动物生存环境破坏和工业需求激增,导致多种动物资源枯竭、濒危,事实证明等到无药可用,则为时已晚。中医药事业的发展,不能再走“资源耗竭模式”的老路,而应该未雨绸缪,提早准备代用品研究。
无论从临床价值、产业价值还是生态环境保护方面代用品研究都势在必行。人工麝香、人工牛黄的成功无疑是动物药代用品可行的明证。对于许多名贵动物药,如羚羊角、蟾酥、蛤蚧等的代用品研究仍任重而道远。在“化学特征类似、功效近同、安全性更高”的原则下,新技术、新方法、新策略、新思路必将加速珍稀动物药代用研究,推动中药现代化研究和可持续高质量发展。
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